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MeDIP试剂盒简介
MeDIP试剂盒采用免疫沉淀的方法富集甲基化的单链DNA片段。试剂盒包含甲基化胞嘧啶特异性单抗，桥连抗体，以及甲基化DNA免疫沉淀实验中需要用到的缓冲液。抗体的高特异性及亲和力可以确保从包含羟甲基化及其他DNA甲基化变体的单链DNA样本中分离甲基化片段。
MeDIP试剂盒选用磁珠，实现简单快速的操作流程。减少实验中清洗及孵育步骤，为研究者节省宝贵时间。试剂盒还包含MseI酶切的人类基因组DNA及PCR引物作为阳性对照，验证实验组的富集效率。另外，试剂盒中的磁条可以为沉淀和富集后的甲基化DNA分离和洗脱提供便利。
5-甲基化（5-mC）DNA免疫沉淀
甲基化DNA免疫沉淀基于免疫捕获技术，使用甲基化胞嘧啶的特异性抗体免疫沉淀基因组中富集甲基化DNA的片段。MeDIP适用于超声或酶切片段化处理后的单链DNA样本。5-mC甲基化单抗协同桥连抗体共同实现富含5-mC甲基化DNA片段的特异性获取。Protein G磁珠的使用可实现快速有效的捕获，沉淀后从磁珠洗脱即可获得特异性的5-mC甲基化DNA样本。这种特异性选择至关重要，因为绝大多数DNA甲基化的分析方法如酶切及重亚硫酸盐转化等都无法实现区分5-甲基化胞嘧啶（5-mC）和5-羟甲基化胞嘧啶(5-hmC)。
MeDIP试剂盒中高亲和力的5-mC抗体只识别甲基化胞嘧啶，不管DNA序列如何，保证了所有序列区间的甲基化胞嘧啶检测。这意味着和使用甲基结合蛋白（MBD）亲和富集的方法只识别CpG甲基化不同，MeDIP方法即使甲基化不发生在CpG双核苷酸序列区间也可以富集到。
MeDIP 试剂盒优势
- 仅富集5-mC甲基化DNA的特异性抗体
- 桥连抗体有助于提高DNA富集效率
- 一步法免疫沉淀反应
- 无需预洗磁珠
- 经过优化的使用磁珠的方案可以减少手动操作时间
- 试剂盒包含人类基因组DNA及PCR引物作为阳性对照验证富集效率
MeDIP方法的流程图
图1：MeDIP方法的流程图
含有5-甲基化胞嘧啶的片段化的基因组单链DNA能够被特异性5-mC单抗结合桥连抗体和磁珠富集出来，富集的DNA经过过夜孵育从磁珠洗脱。
MeDIP 样本富集后NGS测序的样本制备
由于MeDIP试剂盒使用5-mC甲基化抗体只会特异性结合含有甲基化胞嘧啶的单链DNA , 所以DNA样本必须在免疫沉淀前做变性处理。变性的结果是富集的DNA样本无法使用一些常规的NGS建库方法，因为接头需要连接双链DNA。
这个问题可以通过两种方法解决，一种是MeDIP沉淀前在片段化处理的基因组DNA样本中加入NGS接头，另一种是使用与ssDNA兼容的其他建库方案。
如果您希望使用Active motif MeDIP试剂盒结合NGS测序分析，我们建议使用Swift Biosciences公司的Accel-NGS® 1S DNA Library Kits，具体操作请参考说明书
MeDIP 试剂盒组分
MeDIP试剂盒包含5-mC小鼠单抗，桥连抗体，小鼠IgG阴性对照，PIC，buffer C， buffer D，洗脱buffer AM2, 中和buffer，无菌水，PCR管，protein G磁珠，以及用于分离和洗脱5-mC甲基化DNA片段的磁条。
操作手册提供DNA样本片段化处理到定量PCR扩增目的位点的所有实验步骤。
试剂盒包含阳性对照DNA（MseI酶切的人类基因组DNA）和阳性对照PCR引物ZC3H13。
试剂盒的所有组分保存温度从室温到-20°C。请参考说明书查询各组分的正确保存温度。
MeDIP试剂盒数据
MeDIP试剂盒可以从基因组DNA片段中选择性富集富含5-mC的甲基化DNA片段。使用500ng 试剂盒包含的MseI酶切人类基因组DNA样本，在使用和不使用桥连抗体的情况下测试MeDIP试剂盒。洗脱后DNA用 Chromatin IP DNA Purification Kit(Catalog No. 58002) 进行纯化，并用阳性引物 ZC3H13进行定量PCR检测。图2中结果表明配合使用桥连抗体效果更好。图3中富集后DNA使用阳性对照ZC3H13 PCR引物或阴性对照GAPDH PCR引物检测。
图2 MeDIP试剂盒使用和不使用桥连抗体的检测结果
MseI酶切人类基因组DNA（500ng）使用MeDIP试剂盒5-mC单抗或小鼠IgG，在使用和不使用桥连抗体情况下进行检测。洗脱DNA样本经纯化后使用ZC3H13引物定量PCR分析。实验发现，使用5-mC单抗配合桥连抗体能够特异性的富集甲基化DNA，小鼠IgG或者不配合桥连抗体都没有富集效果。实验中使用的ZC3H13位点在人类基因组DNA确定会发生甲基化，因此一定会有效扩增。显示的数据为样本重复2次实验结果。
图3：使用ZC3H13和GAPDH引物的定量PCR结果
MseI酶切人类基因组DNA（500ng）使用MeDIP试剂盒5-mC单抗或小鼠IgG进行检测。洗脱后DNA用 Chromatin IP DNA Purification Kit (Catalog No. 58002) 进行纯化，并用阳性 ZC3H13 PCR引物和阴性GAPDH PCR引物定量PCR。结果发现ZC3H13位点DNA甲基化有富集，GAPDH位点及使用小鼠IgG抗体组没有富集。显示的数据为样本重复2次实验结果。
图4. Active motif的MeDIP试剂盒可用于富集cfDNA甲基化
样本来源于血清分离管（SST）收集的两健康成人（n <25周岁，n >60周岁）血清样本。使用Active motif 的Cell-Free DNA Purification Kit（货号：25503/25504）对cfDNA进行纯化并用Qubit对其定量。利用MeDIP Kit（货号：55009）处理未经消化的cfDNA（200 ng）并使用5-mC抗体和阴性对照小鼠IgG抗体。洗脱的DNA经纯化后使用实时PCR检测，使用 ZC3H13 PCR引物对。5-mc抗体特异性地富集甲基化DNA，小鼠IgG并不特异富集DNA。本实验中分析的ZC3H13基因座在人类基因组DNA中被甲基化，因此可被扩增和被PCR检测到。
图5. Active Motif MeDIP Kit 生成的DNA文库实例
使用Swift Biosciences Accel-NGS™ 1S PLUS DNA Library Kit（货号：10024）构建文库，DNA样本来源为MeDIP Kit处理后经MseI酶切的gDNA和未经酶切的cfDNA。
图6. MeDIP-Seq揭示cfDNA中衰老相关的甲基化差异
样本来源于血清分离管（SST）收集的两健康成人（n <25周岁，n >60周岁）血清样本。使用Active motif 的Cell-Free DNA Purification Kit（货号：25503/25504）对cfDNA进行纯化并用Qubit对其定量。200 ng cfDNA 用于MeDIP Kit 并使用Swift Biosciences Accel-NGS™ 1S PLUS DNA Library Kit（货号：10024）构建高通量测序文库。使用AluI量化确定Input样本文库。对MeDIP样本和Input文库进行测序（Next-Seq500平台38bp PE 测序），并按照Active Motif的MeDIP-Seq标准流程进行处理。使用MACS2算法进行Peaks分析（p-value cutoff =1.00x10-7）。
图7：Active Motif MeDIP试剂盒NGS测序产生结果与CpG密集度正相关性
使用Active Motif MeDIP试剂盒从1ug连接接头的人源PBMC样本富集DNA，后用Illumina测序平台进行NGS测序产生2600万个序列标签。这些标签比对到基因组生成全基因组DNA甲基化图谱。以上图片显示了富集区间（紫色peaks）与CpG密集度(棕褐色)呈现正相关。
图8：Active Motif MeDIP试剂盒检测CpG shores甲基化的NGS测序数据使用Active Motif MeDIP试剂盒从1ug连接接头的人源PBMC样本富集DNA，后用Illumina测序平台进行NGS测序产生2600万个序列标签。这些标签比对到基因组生成全基因组DNA甲基化图谱。以上图片显示了CpG Shores而非CpG岛本身检测到的DNA甲基化的2个例子。数据与大部分甲基化发生在CpG岛临近区间这一最新研究成果相吻合。
MeDIP试剂盒发表文献
如下是选取的使用Active Motif MeDIP试剂盒的发表文献：
“Zac1 regulates astroglial differentiation of neural stem cells through Socs3.” by Schmidt-Edelkraut U. et al. (2013) Stem Cells, doi: 10.1002/stem.1405.
“Activation of BDNF signaling prevents the return of fear in female mice.” by Baker-Andresen D. et al. (2013) Learn Mem, 20(5): 237-240.
MeDIP试剂盒文件
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| Name | Format | Cat No. | Price | |
|---|---|---|---|---|
| MeDIP | 10 rxns | 55009 | ¥6,240 | Buy |
